脂肪酰辅酶A进入线粒体后，在脂肪酸β氧化酶系的催化下，进行脱氢、加水、再脱氢及硫解4步连续反应，使脂酰基断裂生成1分子乙酰辅酶A和l分子比原来少 2个碳原子的脂酰辅酶A，同时还生成1分子NADH和l分子FADH2，此4步反应不断重复进行，最终长链脂酚辅酶A完全裂解成乙酰辅酶A。
因为上述4步连续反应均在脂酰辅酶A的α和β碳原子间进行，最后β碳被氧化成酰基，所以称β氧化。β氧化产生的乙酰辅酶A（CoA）经三羧酸循环彻底氧化分解，所有生成的FADH2和NADH+H+通过呼吸链经氧化磷酸化产生能量。1分子软脂酸经β-氧化彻底分解可净生成129分子ATP。
